Аннотация результатов, полученных в 2015 году
1. Был произведен сбор образцов кала от 153 пациентов, проходивших курсы антибиотикотерапии 3-мя различными группами препаратов (группы 1, 2: две различные комбинированные схемы приема макролидов; группа 3: макролид - бета-лактамный антибиотик - и ингибитор бета-лактамазы). Образцы собирались в временных 2 точках - до и после приема антибиотиков. Из собранных образцов была выделена тотальная ДНК и проведено секвенирования вариабельных участков генов 16S рРНК для определения изменения видового состава микробиоты кишечника при воздействии антибиотиков. Полученные данные были депонированы в сиквенс рид архив NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/ . Идентификатор проекта SRP0669584. 2. На основании данных, полученных при секвенировании вариабельных участков генов 16S рРНК, был произведен анализ изменения бактериальных видов в собранной коллекции. У пациентов в группе 1 наблюдались следующие изменения микробиотного состава: а) На уровне семейств наблюдается повышение относительной представленности Bacteroidaceae (p=0,008); снижение – у неклассифицированного семейства из порядка Clostridiales (p=0,005) , а также у Bifidobacteriaceae (p=0,012), Coriobacteriaceae (p=0,009). б) На уровне родов наблюдается повышение относительной представленности у Bacteroides (p=0,016), Butyrivibrio (p=0,049), Eggerthella (p=0,049); снижение – у Bifidobacterium (p=0,018), Megasphaera (p=0,018), Collinsella (p=0,018), двух неклассифицированных родов - из семейства Coriobacteriaceae (p=0,034) и из порядка Clostridiales (p=0,034). в) На уровне видов удалось выявить повышение представленности неклассифицированного вида из рода Bacteroides (p=0,009); снижение – вида Bifidobacterium adolescentis (p<0,001), Collinsella aerofaciens (p=0,008), а также 7 неклассифицированных видов - из рода Megasphaera (p=0,026), семейства Coriobacteriaceae (p=0,048) и порядка Clostridiales (p=0,008). У пациентов в группе 2 наблюдались следующие изменения микробиотного состава: а) На уровне семейств наблюдается снижение относительной представленности у Bifidobacteriaceae (p=0,006). б) На уровне родов наблюдается снижение относительной представленности Bifidobacterium (p=0,009). в) На уровне видов изменений представленности не было обнаружено. В составе микробиоты кишечника пациентов группы 3 не было обнаружено статистически значимых изменений на уровне относительной представленности ни для одного из таксонов на уровнях семейств, родов и видов. 3. Был проведен анализ распространенности генов антибиотикорезистентности в метагеномах РФ, США, Китая и Дании. Было показано, что наиболее распространенные типы антибиотикорезистентности являются различными устойчивостями к тетрациклину - tet32, tetO, tetQ and tetW. Такое широкое распространение вероятнее всего вызвано тем фактом, что тетрациклин является одним из первых и наиболее широко используемым антибиотиков. Русские и китайские метагеномы имеют более разнообразный резистом по сравнению с остальными группами метагеномов. Они имеют в среднем 52 и 48 типов резистентности соответственно, в то время как метагеномы из Дании и США по 30. Этот феномен также присутствует и на количественном уровне: сравнение представленности генов устойчивости показало что китайские и русские метагеномы имеют наибольшее уровни генов среди всех метагеномов здоровых людей. В исследуемую группу также вошла выборка пациентов с болезнью Крона (n=28). Было обнаружено, что метагеномы пациентов содержали значимо повышенные уровни генов резистентности к 8 из 9 основных классов антибиотиков. 4. Были проанализированы научные публикации, в которых проводилось полногеномное секвенирование микробиоты кишечника человека. По результатам поиска было отобрано 2105 метагеномов мира для последующего анализа. 5. Была разработана вычислительная модель, позволяющая оценить влияние антибиотиков на кишечную флору. Мы рассмотрели влияние антибиотиков на нашу модель кишечника. В качестве модели был взят курс лечения, когда антибиотики применяются совместно с пищей (1 или 3 раза в день) в течение 3, 5, 10 и 30 дней. Мы проанализировали поведение системы в зависимости от дозы антибиотиков, частоты и длительности прием. При различных дозах антибиотика мы получаем схожие результаты, что ожидаемо в рамках исследуемой модели. Большая часть бактерий находится ближе к стенкам кишечника и, так как основная часть лекарств будет проходит через центр кишки, то изменение количества доли лекарств будет незначительно влиять на количество бактерий. Сравнение частота приема антибиотиков (1 или 3 раза в день) показало, что этот параметр влияет на средние число бактерий. Наличие антибиотиков в организме является причиной мутации бактерий. Бактерии, обладающие резистентностью к антибиотикам, защищены от влияния лекарств, но при этом, например, им надо затрачивать энергию на производство белков, блокирующих действие антибиотика. Так как в нашей модели мы не рассматриваем внутриклеточные механизмы, то в качестве платы за резистентность, мы выбрали замедление процессов преобразования веществ. Исходя из этого, мы задали вероятностную функцию мутации, зависящую от концентрации антибиотиков в кишечнике и константы замедления процессов. В зависимости от соотношения параметров, связанных с преимуществом и недостатком резистентности, мы получили три варианта состава нашего бактериального сообщества после окончания лечения. Как и ожидалось, при высокой вероятности мутации в сообществе доминируют устойчивые штаммы, даже после однократного короткого курса лечения. При маленькой возможности мутировать после лечения восстанавливается начальный состав, т. е. остаются только чувствительные штаммы. На промежуточных значениях вероятности мутации мы наблюдаем колебания в соотношениях штаммов. При постоянном приеме антибиотиков спустя время в системе всегда будут доминировать резистентные штаммы. 6. На основе публикаций в которых описывается успешная реализация проекта SHIME (Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem — симулятор экосистемы кишечника человека), нами, совместно с компанией «Обжект лаб» была разработана и собрана аналогичная схема установки. Данная установка поможет оценить влияние различных факторов на состав микробиоты кишечника in vitro. 7. Была разработана система визуализации для отображения статистики по представленности генов антибиотико-резистентности. Прототип модели представлен на сайте http://metagenomics.datalaboratory.ru/. Интерфейс предоставляет возможность выбора групп генов, ассоциированных с резистентностью к определенным типам антибиотиков и настройки когорт метагеномов при помощи множества фильтров (пол, раса, возраст, тяжесть заболевания, доза принимаемых препаратов), для которых требуется отобразить представленность. 8. Был разработан алгоритм сборки метагеномных данных для определения регионов окружающих гены резистентности Совместно с Институтом точной механики и оптики был разработан алгоритм анализа метагеномных данных, основанный на геномной сборке путем построения графа де Брейна. Алгоритм включает в себя этап совместной сборки набора метагеномов, который позволяет выделять узлы графа, представляющие собой группы генов, близко расположенных в бактериальных геномах, и объединенных общей последовательностью. Таким образом, каждая компонента очерчивает основные варианты окружения “центрального” для нее гена в различных бактериальных геномах, а одновременное использование набора метагеномов позволяет детектировать пути, которые теряются или отбрасываются обычными сборщиками при обработке графа для отдельных образцов с целью максимизации целевых параметров сборки.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
При выполнении работ в 2016 году из собранной на первом этапе коллекции образцов кала были выбраны 17 образцов кала, полученные от 6 пациентов с диагнозом «хеликобактериоз» в трех временных точках на протяжении курса противохеликобактерной терапии: непосредственно до начала курса приема антибиотиков (1), на следующий день после завершения курса приема антибиотиков (2) и через 1 месяц после завершения курса приема антибиотиков (3). Для 10 из них была осуществлена процедура полногеномного секвенирования тотальной ДНК с использованием генетического анализатора HiSeq2500 (Illumina) в режиме Rapid Run в формате парноконцевого чтения фрагментных библиотек 2х250 пар нуклеотидов. Результаты полногеномного секвенирования депонированы в общедоступном репозитории European Nucleotide Archive - ENA (идентификатор проекта: PRJEB18265, URL: https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB18265). Из этих же образцов кала были высеяны чистые бактериальные культуры, которые в последствии анализировали на устойчивость к шести антибиотикам диско-диффузионным методом. Далее для бактерий одного вида, присутствующих в образцах как до, так и после лечения, и продемонстрировавших значительные изменения в чувствительности/резистентности к использованным антибиотикам, осуществляли процедуру полногеномного секвенирования. Для этого готовили фрагментные библиотеки и секвенировали их с использованием генетического анализатора HiSeq2500 (Illumina) в режиме Rapid Run в формате парноконцевого чтения 2х250 пар нуклеотидов, всего 21 образец. Нуклеотидные последовательности геномов депонированы в общедоступном репозитории European Nucleotide Archive (идентификатор проекта: PRJEB18432, URL: http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB18432&portal=assembly). В полученных метагеномных и геномных данных после процедуры сборки выявляли наличие генов антибиотикорезистентности и определяли их окружение. Далее в результате работ за отчетный период разработан алгоритм идентификации окружения гена, с помощью которого был выполнен анализ метагеномных и геномных данных путем визуализации на предмет обнаружения свидетельств событий горизонтального переноса, а также прослеживания возможного пути передачи АР-генов в пределах микробиоты кишечника человека. Данный алгоритм был применен для анализа наших собственных геномных и метагеномных данных, полученных на данном этапе проекта (п. 2.3 работ). В результате анализа в составе графовой структуры нами были найдены гены антибиотикорезистентности, обладающие высокой степенью гомологии с известными плазмидными последовательностями, отсутствовавшими в образцах до антибиотикотерапии и выявленными в образцах после антибиотикотерапии, что позволило нам проследить путь перехода данных генов из одного окружения в другое. В частности, в качестве примера исходя из факта наличия генов tetM, tetL и ErmF в геноме Enterococcus faecium и топологии соответствующего им метагеномного графа после приема антибиотиков, можно предположить, что данные гены входят в состав одной плазмиды, приобретенной указанным микроорганизмом путем конъюгации. Далее в результате работ за отчетный период разработанная прототипная модель передачи АР была использована для симуляции приобретения ранее чувствительным патогеном устойчивости к антибиотикотерапии в результате передачи генов резистентности от других представителей микробиоты кишечника путем варьирования значений контрольных параметров. В рамках выполнения задачи работы с микробиомом в реакторе-модели кишечника в результате тестирования показана возможность использования симулятора экосистемы кишечника человека в качестве системы мониторинга антибиотикорезистентности. При решении задачи разработки визуализаций разработан интерактивный веб-сервис для наглядной визуализации потенциала резистентности микробиоты кишечника человека среди образцов из разных стран ResistoMap. Сервис визуализирует относительные представленности генов-детерминант устойчивости к антибиотикам, распространение мутаций в генах-мишенях, обеспечивающих устойчивость, а также представленность генов, ответственных за устойчивость к биоцидам и тяжелым металлам. ResistoMap позволяет исследовать глобальный ландшафт устойчивости к антибиотикам в кишечной микробиоте, находить закономерности в распределениях потенциала резистентности и помогает строить гипотезы о его связях с национальными особенностями потребления антибиотиков. Сервис разработан с использованием AngularJS, CoffeeScript, D3.js, TopoJSON и доступен по адресу http://resistomap.datalaboratory.ru/.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
При выполнении работ в 2017 году были проведены эксперименты по моделированию приобретения детерминант устойчивости к антибиотикам в микробиоме кишечника. За основу модели брали схему противохеликобактерной терапии, в соответствии с которой был проведен сбор образцов микробиоты кишечника на первом году выполнения проекта. Предложенная схема эксперимента реализовывала модель противохеликобактерной терапии в условиях in vitro с использованием в качестве потенциального донора детерминант устойчивости к антибиотикам образцы метагеномной ДНК, полученной из кала пациентов после курса противохеликобактерной терапии, а в качестве реципиента – чувствительных штаммов Enterococcus faecium, изолированных от пациентов до начала курса противохеликобактерной терапии. Факт приобретения устойчивости трансформантов подтверждали диско-диффузионным методом в условиях культивирования in vitro. Анализ генетических детерминант устойчивости в геномах трансформантов проводили по результатам полногеномного секвенирования. По результатам анализа было показано, что обнаруженный эффект возрастания устойчивости к антибиотикам не является результатом горизонтального переноса ДНК, но может быть обусловлен мутагенезом de novo. Спроектирован биоинформатический пайплайн Taatoo, основанный на разработанном в рамках данного проекта алгоритме MetaCherchant (https://github.com/ctlab/metacherchant), который позволяет извлекать геномный контекст целевой последовательности из метагеномных данных. Использование данного метода в сравнении с общепринятыми методиками повышает вычислительную эффективность, а также позволяет наиболее полно отображать контекст целевых последовательностей в виде графовой структуры (в формате GFA) и набора юнитигов в FASTA формате. Данный пайплайн был использован для анализа 1638 метагеномных образцов, полученных от индивидов из 15 стран в ходе 12 метагеномных исследований, ранее представленных в формате ResistoMap. Результаты анализа включают в себя информацию о представленности классов детерминант устойчивости к антибиотикам, бактерий-носителей детерминант резистентности, окружения генов-детерминант резистентности и преобладающих путях передачи детерминант резистентности. Результаты проведенного анализа представлены в разделе «Резистом кишечника человека» разработанного в ходе работ текущего года портале. Разработанный в ходе выполнения портал resistome.rcpcm.org содержит основные результаты выполнения текущего проекта. В разделе «Наши инструменты» представлен перечень биоинформатических инструментов, разработанных в процессе реализации проекта: ResistoMap- интерактивная визуализация генетических детерминант резистентности к антибиотикам, биоцидам и тяжелым металлам присутствующих в микробиоте кишечника человека; MetaFast - набор инструментальных средств для расчета ряда статистических данных метагеномных последовательностей и построения матрицы расстояний между ними; MetaCherchant - инструмент для анализа геномного контекста детерминант резистентности к антибиотикам в кишечных метагеномах; Taatoo (Taxonomic association toolchain) - пайплайн для расчета таксономических ассоциаций между целевой последовательностью и различными таксономическими уровнями бактерий; VERA - агентная модель, для симуляции распространение антибиотикорезистентности в популяции. В продолжении работы в рамках выполнения задачи создания инструмента моделирования возникновения и распространения резистентности была модифицирована разработанная в 2016 году агентная модель переноса генов резистентности от микробиоты человека к патогену. Среди основных модификаций - введение параметра постоянного уровня резистентности микробиоты и коррекция условий переходов между базовыми состояниями. Для удобства использования создан интерфейс для визуализации результатов запуска модели - VERA.viewer, динамически в течении всего времени моделирования и в виде PDF-отчета.